Уровни организации белка

①. Первичная структура белкауникальная линейная последовательность аминокислот, соединенных пептидной связью между карбоксильной группой предыдущей аминокислоты и аминогруппой последующей.

пептидная связь

О R2 О

|| | ||

Н2N - СН – С – N - СН - С - N – CH - СООН пептидный остов

N-конец п/п цепи | | | | С-конец п/п цепи

R1Н H Rn

Пептидные связи располагаются в транс-конфигурации, в результате боковые R аминокислот находятся на наиболее удаленном расстоянии друг от друга. Пептидная связь отличается большой прочностью и в организме человека ее разрыв происходит под действием протеолитических ферментов (специфический гидролиз), а вне организма – при высоких температурах, давлении, сильном закислении или защелачивании среды(неспецифический гидролиз).

Последовательность а/к в первичной структуре белков определяет их пространственную конформацию и специфическую функцию.

②. Вторичная структураконформация полипептидной цепи, обусловленная водородными связями, образованными функциональными группами пептидного остова (между кислородом карбонильной группы –СО- и водородом иминогруппы –NН-):

водородная связь (через 4 а/к в α–спирали)

О-------------------------------------------------------------Н

// /

Н2N- СН – С–NН - СН - СО–NН - СН - СО–NН - СН -СО–N–СН - СООН спирализация

/ / / /

R1 R2 R3 R4

Во вторичной структуре белка имеются участки с регулярной структурой (α–спираль и β-складчатая структура (фигура складчатого листа нерегулярной структурой(петле- и кольцеобразные структуры,включающие от 3 до 15 аминокислот, которые имеют значение для компактизации белков).

α–спираль– наиболее распространенная структура, в которой на каждый виток спирали приходится 3,6 аминокислотных остатка. Водородные связи ориентированы вдоль оси спирали.

β-складчатая структура- возникает за счет водородных связей между атомами пептидных групп линейных участков одной полипептидной цепи или разных цепей (параллельных – цепи ориентированы в одном направлении, т.е. совпадают С- и N-концы цепей, или антипараллельных - С- и N-концы цепей антипараллельны). Водородные связи ориентированы перпендикулярно полипептидной цепи. Т.о., выделяют внутри- и межцепочечную β-складчатую структуру.

③. Третичная структура – трехмерная конформация белка, образованная за счет взаимодействия между радикалами (R) аминокислот, которые могут находиться на любом расстоянии друг от друга. В образовании третичной структуры участвуют: 1). Гидрофобные взаимодействия - слабые взаимодействия между неполярными радикалами аминокислот (образуют гидрофобное ядро белка); 2). ионные и водородные – между гидрофильными R а/к; 3). ковалентныедисульфидные (между остатками цистеинов, находящихся в разных местах полипептидной цепи); пептидные, в образовании которых участвуют карбоксильная и аминогруппы, входящие в R аминокислот). Белки в третичной структуре могут иметь глобулярную (основная часть белков) и фибриллярную конформацию. Третичная структура белка является функционально активной.

Для белков характерна конформационная лабильность – свойство белков незначительно изменять пространственную структуру за счет разрыва одних и образования других слабых связей (ионных, водородных, гидрофобных) при изменении химических и физических свойств среды, и при взаимодействии с другими молекулами, без потери биологической активности. Это свойство белков имеет большое значение для функционирования белков в живых клетках (например, функция Нв реализуется за счет кооперативного изменения конформации α- и β – субъединиц, что обеспечивает ускорение присоединения кислорода в легких и облегчает его освобождение в тканях).

Белки, содержащие в п/п цепи более 200 а/к, имеют независимые от других участков п/п цепи компактно свернутые фрагменты – домены, имеющие конформацию глобулярных белков и отвечающие за определенный биологический эффект (напр., гексокиназа состоит из 2-х доменов – один связывает АТФ, другой – глюкозу, и при их смыкании происходит пространственное сближение соответствующих субстратов, что ускоряет реакцию фосфорилирования глюкозы).

④. Четвертичная структура (олигомерные белки) – ассоциация 2-х и более полипептидных субъединиц, имеющих третичную структуру. Объединены субъединицы слабыми связями – гидрофобными, ионными, водородными. Субъединицы могут быть одинаковыми (в ЛДГ1 - 4Н субъединицы и ЛДГ5 - 4М) или разными (ЛДГ2,3,4; Нв: 2α и 2β). Между субъединицами существует пространственное и химическое соответствие поверхностей – комплементарность.

Фолдинг белка – процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную пространственную биологически активную структуру. Фолдинг протекает при участии специальной группы белков – шаперонов и ферментов – фолдаз. Шапероны стабилизирут пространственную конформацию белков, предупреждают преждевременную неправильную агрегацию субъединиц олигомерных белков, сопровождают белки в определенные компартменты клетки, защищают белки от денатурации в условиях клетки. Шапероны делятся: 1. в соответствии с молекулярной массой - на 6 групп (Ш 100-110 кД; Ш-90; Ш-70, Ш66-70; Ш-60, Ш-40; Ш-15-30); 2. на конститутивные (скорость их синтеза постоянна и не зависит от стрессовых воздействий) и индуцибельные – «белки теплового шока» (их синтез в нормальных условиях идет слабо, но резко увеличивается при стрессовых воздействиях – высокая температура, гипоксия, инфекция, воздействие химических токсических веществ, тяжелых металлов, изменение рН среды, УФО).

загрузка...

Прионы – особый класс белков, обладающих инфекционными свойствами, которые, попадая в организм человека или спонтанно возникая в нем, могут вызывать прионовые болезни («медленные инфекции», т.к. очень длительный инкубационный период) - быстро прогрессирующие заболевания, характеризующиеся тяжелым поражением ЦНС. Прионовый белок кодируется тем же геном, что и его нормальный аналог, т.е. оба имеют идентичную первичную структуру, но обладают различной конформацией вследствие нарушения фолдинга прионового белка. Прионовый белок характеризуется высоким содержанием β-слоев и обладает высокой устойчивостью к действию протеаз, физических, химических факторов и, попадая в нервную ткань, способствует превращению нормального белка в прионовый за счет межбелковых взаимодействий, что сопровождается образованием губчатых амилоидных структур, нарушающих функционирование нейронов. Примеры прионовых болезней – «коровье бешенство», болезнь – «куру», фатальная семейная инсомния.

Фибриллярные белки: 1. фиброин шелка и паутины, 2. кератины волос, 3. адгезивные белки – ламинин, фибронектин, нидоген, интегрины, 4. коллагены, эластин, 5. миозин в мышцах, 6. фибрин – белок системы свертывания крови и др.

Особенности строения коллагена: коллаген I типа состоит из 3-х α–цепей, каждая из которых включает 1000 а/к остатков. В первичной структуре α–цепей выделяют повторяющийся 330 раз «коллагеновый мотив», представляющий собой триплет –(гли-х-у)-, в котором 1-ю позицию всегда занимает глицин (1/3 от всех а/к в коллагене), х - пролин, у – часто гидроксипролин, гидроксилизин или другая аминокислота. Гидроксипролин и гидроксилизин образуются при посттрансляционном созревании коллагена при участии вит.С-зависимых гидроксилаз. Из 3-х α–спиралей (имеют более вытянутую форму, вследствие особенностей а/к состава, и на один виток α–спирали приходится 3 а/к остатка, а не 3.6, как в глобулярных белках) формируется структурная единица коллагеновой фибриллы – тропоколлаген, в котором в местах максимального сближения α–цепей находится глицин, не имеющий бокового радикала, и между 3-я α–спиралями возникают дополнительные водородные связи при участии гидроксипролина и гидроксилизина. Из молекул тропоколлагена формируются тропоколлагеновые нити, которые укладываются одна относительно другой со смещением на ¼ длины, формируя коллагеновые фибриллы. Молекулы тропоколлагена удерживаются между собой посредством «лизин-лизиновых» сшивок, которые образуются при участии альдегидных производных остатков лизина и гидроксилизина при участии В6и РР-зависимой лизилоксидазы. Несколько рядов коллагеновых фибрилл формируют коллагеновые волокна, наделенные высокой прочностью.

Методы выделения, фракционирования и очистки белков:

1. высаливание – метод очистки белков, основанный на различиях в их растворимости при разной концентрации соли в растворе (чем выше растворимость белка, тем большая концентрация соли необходима для его осаждения). При высаливании происходит осаждение белков из растворов под действием солей щелочных и щелочноземельных металлов. При этом белок не теряет способность вновь растворяться после удаления солей методами диализа и гель-фильтрации, и не теряет свои нативные свойства. Различные белки высаливаются из растворов при разных концентрациях нейтральных растворов сульфата аммония, что используется в клинике для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении) и альбуминов (осаждаются при 100% насыщении). Для более тонкого разделения белков плазмы крови на фракции используют метод Конна – фракционирование достигается при использовании разных концентраций этанола при низкой температуре: альбумины выявляются при t=5о, рН=4,8 и спирт-40%; α1-глобулины - при t=5о, рН=5.2, спирт-40%; α2-глобулины - при t=5о, рН=5.8, спирт-40%; β и γ- глобулины – при t=5о, рН=6.9, спирт-25%.

2. диализ – метод очистки белков от низкомолекулярных примесей, основанный на том, что белки, имеющие высокую M.м., не способны проходить через полупроницаемую мембрану, пропускающую только низкомолекулярные вещества.

3. гель-фильтрация – метод «молекулярных сит», основанный на том, что вещества, отличающиеся по молекулярной массе, по-разному распределяются между неподвижной фазой (жидкость внутри гранул геля с разной величиной пор, в которую проникают низкомолекулярные вещества и белки с небольшой М.м.) и подвижной фазой, с которой вымываются крупные белки. В гель-фильтрации используют хроматографичекие колонки, заполняемые сефадексом, агарозой с разной величиной гранул. Смесь белков, пропуская через колонку, элюируют растворителем. При этом высокомолекулярные белки выходят из колонки первыми в составе подвижной фазы, а низкомолекулярные, задерживаясь в порах геля, вымываются под действием больших объемов и элюирующей силы растворителя.

4. электрофорез – метод, основанный на том, что заряженные молекулы белков (пептидов, аминокислот) перемещаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. При этом белки, имеющие (при данном значении рН и ионной силе раствора) отрицательный заряд, движутся к аноду, а положительный заряд – к катоду. На скорость движения также влияет М.м. и форма молекул белка. Электрофорез проводят на разных носителях – бумага, крахмальный гель, полиакриламидный гель. При электрофорезе на бумаге выделяют 5 фракций белков сыворотки крови: альбумины, α1, α2, β, γ- глобулины, в полиакриламидном геле – 18 фракций.

5. ионообменная хроматография - метод разделения белков, различающихся по суммарному заряду, при определенных значениях рН и ионной силы раствора. При пропускании раствора белков через хроматографическую колонку, заполненную твердым пористым заряженным сорбентом, часть белков задерживается на нем в результате электростатических взаимодействий. В качестве сорбентов используют ионообменники: положительно заряженные анионообменники для белков, имеющих суммарный отрицательный заряд и отрицательно заряженные катионообменники – для положительно заряженных белков. Адсорбированные на ионообменном сорбенте белки элюируют буферным раствором с разным значением рН и концентрации соли, получая разные фракции белков.

6. аффинная хроматография – основана на специфическом связывании белков с лигандами, прикрепленными к твердому носителю. Лигандом может быть субстрат или кофермент – для выделения фермента, антиген – для выделения антител. Аффинная хроматография отличается высокой избирательностью и позволяет очистить белок в тысячи раз.

7. денатурация – разрушение нативной конформации белков за счет разрыва ионных, гидрофобных, водородных связей без разрыва пептидных связей первичной структуры белка. Происходит денатурация под действием денатурирующих факторов – высокая t>50о; изменения рН при действии концентрированных кислот и щелочей; действие органических веществ – этанол, фенол, мочевина; соли тяжелых металлов (ртуть, свинец), детергенты (различные мыла) и др. При денатурации изменяются физико-химические свойства белков: снижается растворимость вследствие уменьшения заряда, нарушения гидратной оболочки и образования агрегатов белка, что сопровождается выпадением белка в осадок и потерей биологической активности.

7. осаждение белков – может быть вызвано созданием рН среды, равного изоэлектрической точке – рI (pI – значение рН среды, при котором белок становится электронейтральным). Условиями растворимости белка являются наличие заряда и гидратной оболочки.

8. цветные реакции на аминокислоты и белки – 1. нингидриновая реакция на α-аминокислоты основана на том, что бесцветный нингидрин, реагируя с аминокислотой, конденсируется в виде димера через атом азота, отщепляемый от α-аминогруппы аминокислоты. В результате образуется пигмент красно-фиолетового цвета и интенсивность окраски пропорциональна количеству аминокислот в растворе; 2. биуретовая реакция – позволяет открыть пептидную связь в белке за счет образования сине-фиолетового биуретового комплекса в результате соединения меди с пептидной группировкой белка в щелочной среде 3. ксантопротеиновая проба – позволяет выявлять ароматические аминокислоты (фен, тир, трп) при обработке раствора белка концентрированной азотной кислотой – появляется желтое окрашивание, 4. реакция Сакагучи – на гуанидиновую группу аргинина – происходит розово-красное окрашивание в присутствии α-нафтола, 5. реакция Фоля – на SН-группу цистеина, за счет образования черного осадка сульфида свинца PbS.

Физико-химические свойства белков: 1. буферные свойства, обусловленные наличием в молекуле белка как кислотных (карбоксильных), так и основных (амино-) групп. 2. осаждаемость в изоэлектрической точке, 3. высаливаемость с сохранением нативной структуры и активности, 4. денатурируемость – с изменением физико-химических свойств и потерей биологической активности, 5. недиализуемость, 6. электрофоретическая подвижность.

Эмбриоспецифические белки (онкофетальные белки) - альфа-фетопротеин (α-ФП), эмбриональный преальбумин (ЭПА), трофобластспецифичный бета-гликопротеин (Тβ–ГП), другие – синтезируются на разных этапах эмбриогенеза, выполняя определенную роль в развитии плода (напр., α-ФП обладает способностью связывать эстрогены и защищать плод от избытка эстрогенов матери) и в норме выявляются только у беременных женщин и в плазме плода. В других случаях, обнаружение этих белков в крови взрослого человека является маркером опухолевого роста и используются в диагностике рака (поэтому эти белки называют онкофетальными белками или раково-эмбриональными). Так, альфа-фетопротеин выявляется при гепатоцеллюлярном раке и раке яичка у взрослых, гепатоме у детей; ЭПА – при аденокарциноме, Тβ–ГП – при раке матки.

Классификация простых и сложных белков: протеины – простые белки, состоят только из аминокислот, протеиды – сложные белки, состоят из апопротеина (белковая часть молекулы) и простетической группы (небелковый компонент). К простым белкам относятся: 1. отрицательно-заряженные (содержат высокий процент дикарбоновых а/к: аспартат и глутамат): альбумины (60%, 35-50 г/л крови) – участвуют в транспорте жирных кислот, стероидных гормонов, билирубина; создают и поддерживают онкотическое давление, вязкость крови, рН крови, являются питательным резервом, и глобулины (40%, 20-30 г/л): (фракции: α1 - связывают токсичный билирубин, содержатся в ЛПВП крови, α2 – белки системы свертывания крови, ангиотензин, β–трансферрин, церулоплазмин, протромбин, γ- иммуноглобулины крови); 2. положительно-заряженные (≻лизина, аргинина) гистоны1, Н, Н, Н3, Н4); 3. протамины; 4. проламины. Сложные белки делятся на фосфо-, хромо-, глико-, липо- (ЛПОНП, ЛПНП, ЛПВП), нуклео-, металлопротеиды (трансферрин, ферритин, церулоплазмин).

Хромопротеиды – цветные сложные белки, которые в зависимости от простетической группы делятся на: 1. гем-содержащие – Нb (НbР, НbF, НbА), Мb, цитохромы (Р450, а, а3, в, с1, с), каталаза, пероксидаза; 2. ретиналь-содержащие (родопсин, йодопсин – фоторецепторы палочек и колбочек, участвующие в световосприятии), 3. флавопротеиды – ФАД и ФМН-содержащие дегидрогеназы.

Нbхромопротеид, апопротеин которого имеет четвертичную структуру и состоит из 2-х α-субъединиц (по 141 а/к) и 2-х β (по 146 а/к), простетическая группа4 молекулы гема (степень окисления железа 2+; атом железа соединяется с атомами азота 4-х пиррольных колец молекулы гема, с атомом азота гистидина в 8 положении F-цепи каждой белковой субъединицы и с О2). За счет конформационной лабильности скорость насыщения кислородом от α1 до β2 субъединицы в 500 раз (S-образная кривая насыщения кислородом). Особенности обмена в эритроцитах: гликолиз в э/ц является: 1. источником АТФ (2 реакции субстратного фосфорилирования), 2. источником 1,3дифосфоглицерата, который изомеризуется в 2,3 дифосфоглицерат (ДФГ) – регулятор сродства Нb к кислороду (↓-ет сродство и, соответственно, ↑ отдачу О2 в ткани). Апотомический распад глюкозы является источником восстановленных НАДФНН+, которые необходимы: а). для восстановления -групп глутатиона – кофермента глутатион-пероксидазы, инактивирующей активные формы кислорода, б). для восстановления -групп белков мембран э/ц, что поддерживает их целостность, и в). НАДФНН+-редуктазы, восстанавливающей Меt Hb(Fe3+) в Hb(Fe2+). Мbхромопротеид, имеющий третичную структуру (153 а/к), простетическая группа – 1 молекула гема.

Нуклеопротеиды: делятся на ДНК-содержащие - нуклеосома, и РНК-содержащие - рибосома, информосома, информофер. Нуклеосома включает 8 молекул гистоновых белков, 4-х типов: (Н, Н, Н3, Н4) х 2, которые образуют октамер, выполняющий функцию «катушки» для наматывания двойной спирали ДНК (〜140 п/н). При этом происходит компактизация ДНК и образуются участки «молчащей», нетранскрибируемой ДНК. В линейных участках (〜60 п/н) ДНК соединяется с Н1 типом гистоновых белков.

СИНТЕЗ БЕЛКА происходит в 2 этапа: 1. транскрипция – переписывание последовательности нуклеотидов (н/т) ДНК в последовательность н/тиРНК по принципу комплементарности (между пуринами и пиримидинами: А=Т(У), ГЦ), и с заменой Т на У. 1′. посттранкрипционный процессинг – созревание про-иРНК: вырезание интроновсплайсинг (сшивание экзонов) → «кэпирование» иРНК по 5′-концу: (+)-е метилированных н/т), и (+)-е полиаденилата по 3′-концу. 2. трансляция (происходит на рибосомах при участии тРНК, приносящей а/к к месту синтеза полипептидной цепи) – раскодирование последовательности н/тиРНК в последовательность аминокислот белка: 3 н/ткодируют 1 а/к (триплетность генетического кода). Свойства генетического кода: универсальность, триплетность, вырожденность, неперекрываемость. 2′. посттрансляцинный процессинг (фолдинг – процесс сворачивания белка в правильную пространственную биологически активную конформацию при участии белков-шаперонов;присоединение простетической группы в сложных белках).

Процессы транскрипции, трансляции, репликации протекают в 3 этапа: инициация, элонгация, терминация.

РЕПЛИКАЦИЯ ДНК: удвоениеДНК (при делении клетки) происходит при участии следующих ферментов: 1. хеликаза - раскручивает двойную спираль ДНК с образованием репликативной вилки, 2. топоизомераза – предупреждает суперспирализацию ДНК в местах формирования репликативной вилки, 3. праймаза – катализирует образование «затравочного» праймера (олигорибонуклеотид), с которого начинается синтез ДНК, 4. ДНК-полимераза III (основной фермент репликации, катализирующий синтез лидирующей цепи ДНК и отстающей цепифрагментами Оказаки в направлении 5′→ 3′), ДНК-полимераза I(удаляет затравочный праймер и замещает на олигодезоксирибонуклеотид),ДНК-полимераза II(участвует в репарации – устранении ошибок); 5. ДНК-лигаза (сшивает фрагменты Оказаки, соединяет 2 цепи ДНК).

Денатурация-ренатурация ДНК используется в методе - ПЦР(полимеразная цепная реакция): 1. при t〜900С происходит денатурация ДНК с разрывом водородных связей между комплементарными парами азотистых оснований: А=Т и Г≡Ц, и образованием 2-х полинуклеотидных цепей, к которым: 2. при t〜550С присоединяется праймер, и далее: 3. каждая полинуклеотидная цепь служит матрицей для синтеза комплементарных цепей ДНК при участии ДНК-полимеразы термальных бактерий при повышении t〜 800С.




Ответить

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Вы можете использовать HTML- теги и атрибуты:

<a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>

91 − = 89